Plasmide CRISPR d'Activation (h) MTAP: sc-406223-ACT

La MTAP humaine (méthylthioadénosine phosphorylase) catalyse la phosphorolyse de la 5′‑méthylthioadénosine en adénine et en 5‑méthylthioribose‑1‑phosphate, reliant la voie de sauvetage de la méthionine au métabolisme des purines et à l’équilibre de la méthylation cellulaire. En maintenant l’apport en adénine et en régulant les niveaux de MTA, la MTAP influence le métabolisme des polyamines, le flux de transmethylation et, plus largement, l’homéostasie biochimique liée au métabolisme à un carbone. La perte de MTAP est fréquemment observée dans des cancers présentant des délétions de 9p21 à proximité de CDKN2A/CDKN2B, créant des dépendances métaboliques caractéristiques et des contextes de signalisation altérés pertinents pour la biologie tumorale. Moduler l’expression de MTAP est donc utile pour analyser la reprogrammation métabolique, l’homéostasie des nucléotides et la disponibilité de cofacteurs épigénétiques dans des modèles pertinents pour les maladies.

MTAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTAP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MTAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTAP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTAP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MTAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTAP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MTAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MTAP dans les cellules tumorales présentant une expression de MTAP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.