Plasmide CRISPR d'Activation (h) MSK2: sc-404150-ACT

RPS6KA4 code la kinase 2 activée par les mitogènes et le stress (MSK2), une kinase nucléaire sérine/thréonine située en aval des voies de signalisation ERK1/2 et p38 MAPK. MSK2 phosphoryle des régulateurs de la chromatine et de la transcription, notamment l’histone H3 et des facteurs de la famille CREB/ATF, couplant ainsi les signaux extracellulaires à l’expression de gènes de réponse immédiate et au remodelage de la chromatine dépendant des stimuli. Par ces activités, MSK2 contribue au contrôle des programmes transcriptionnels inflammatoires et de réponse au stress, ainsi qu’à la régulation de la prolifération et de la différenciation dans de nombreux contextes cellulaires. Une dérégulation de la signalisation MAPK–MSK a été impliquée dans une expression altérée des cytokines et des états transcriptionnels oncogéniques, faisant de RPS6KA4 un nœud utile pour étudier la régulation génique pilotée par les voies de signalisation.

MSK2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPS6KA4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MSK2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPS6KA4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPS6KA4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MSK2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPS6KA4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MSK2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MSK2 dans les cellules tumorales présentant une expression de RPS6KA4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.