MKP-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400850-ACT

Dual-Specificity-Phosphatase 6 (DUSP6), auch bekannt als MKP-3, ist eine zytosolische MAP-Kinase-Phosphatase, die bevorzugt ERK1/2 dephosphoryliert und inaktiviert und dadurch eine negative Rückkopplungskontrolle der RAS–RAF–MEK–ERK-Signalkaskade bereitstellt. Indem MKP-3 ERK-getriebene transkriptionelle Programme begrenzt, beeinflusst es Proliferation, Differenzierung und die reizabhängige Dynamik der Signalweiterleitung stromabwärts von Rezeptor-Tyrosinkinasen wie EGFR und FGFR. Eine veränderte Expression oder Aktivität von DUSP6 kann den Output des MAPK-Signalwegs umformen und wurde in Kontexten beschrieben, in denen die ERK-Signalgebung dysreguliert ist, darunter mehrere krebsassoziierte Modelle sowie Studien zur Entwicklungssignalgebung. Als Modulator des Signalwegs wird DUSP6 häufig eingesetzt, um die MAPK-Rückkopplungsregulation und Signalanpassung zu untersuchen.

MKP-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DUSP6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MKP-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DUSP6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DUSP6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MKP-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DUSP6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MKP-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MKP-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DUSP6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.