Plásmido CRISPR de Activación (h) Mitofilin: sc-403617-ACT

El gen humano IMMT codifica mitofilina, una proteína andamiaje esencial de la membrana mitocondrial interna y componente central del complejo MICOS (sistema organizador de los sitios de contacto mitocondriales y de las crestas). La mitofilina coordina la formación de las uniones de las crestas, estabiliza la organización de la cadena respiratoria y favorece la importación de proteínas mitocondriales y el tráfico de lípidos en los sitios de contacto intermembrana, vinculando la arquitectura mitocondrial con la fosforilación oxidativa y la homeostasis metabólica. La alteración de la estructura de las crestas dependiente de IMMT se asocia con cambios en la dinámica mitocondrial, deterioro de la bioenergética y una mayor susceptibilidad a respuestas celulares de estrés. IMMT se ha investigado en el contexto de trastornos con disfunción mitocondrial, incluyendo enfermedades neurodegenerativas y cardiometabólicas, donde la remodelación de las crestas puede influir en la señalización y en las vías de supervivencia celular.

Mitofilin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de IMMT sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Mitofilin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus IMMT en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional IMMT, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Mitofilin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo IMMT y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Mitofilin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Mitofilin en células tumorales con expresión de IMMT silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.