MetAP-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402529-ACT

Das humane Gen **METAP2** kodiert die Methionin-Aminopeptidase 2 (MetAP-2), eine zytosolische Metalloprotease, die das initiierende Methionin von neu synthetisierten Polypeptiden entfernt. Dies ist ein zentraler Schritt der N-terminalen Prozessierung, der die Proteinstabilität, Lokalisation und die nachgeschaltete N‑terminale Acetylierung beeinflussen kann. Über ihre Rolle in der kotranslationalen Proteinreifung trägt MetAP-2 zur Proteostase bei und wirkt sich auf translationsgekoppelte Wachstumsprogramme sowie die Zellzyklusprogression aus. Die METAP2-Aktivität wurde mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die die Proliferationsfähigkeit und die Anpassung an zellulären Stress steuern, was sie für mechanistische Studien zu fehlreguliertem Wachstum in der Onkologie sowie für Untersuchungen metabolischer und angiogener Phänotypen relevant macht. Eine veränderte METAP2-Expression oder -Funktion kann daher als Knotenpunkt dienen, um zu untersuchen, wie N‑terminale Prozessierung mit Signalnetzwerken und zellulärer Fitness zusammenwirkt.

MetAP-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen METAP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MetAP-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des METAP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der METAP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MetAP-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native METAP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MetAP-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MetAP-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem METAP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.