MDA5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-427977-ACT

Das murine Gen **Ifih1** kodiert **MDA5 (IFIH1)**, eine zytosolische RNA-Helikase der DExD/H-Box-Familie, die lange doppelsträngige RNA erkennt, wie sie während der Virusreplikation entsteht, sowie weitere Quellen aberranter RNA. Nach Ligandenbindung signalisiert MDA5 über den Adapter **MAVS** und aktiviert die **IRF3/IRF7**- und **NF-κB**-Signalwege, wodurch **Typ-I-Interferone** und **interferon-stimulierte Gene** induziert werden, die angeborene und adaptive Immunantworten prägen. Diese RNA-Sensor-Achse beeinflusst die antivirale Restriktion, Programme inflammatorischer Zytokine sowie die Wechselwirkungen mit Autophagie und der Dynamik von Stressgranula. Eine fehlregulierte MDA5-Aktivität und Interferon-Signalgebung wurden mit Interferonopathien und autoimmunähnlichen Entzündungen in Verbindung gebracht und sind zudem relevant für die Tumor-Immunerkennung sowie für Wirt–Pathogen-Interaktionen in experimentellen Modellen.

MDA5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ifih1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MDA5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ifih1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ifih1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MDA5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ifih1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MDA5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MDA5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ifih1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.