Mast Cell Tryptase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400887-ACT

TPSAB1 kodiert die Mastzell-Tryptase (Tryptase-α/β), eine sezernierte Serinprotease, die in den Granula von Mastzellen gespeichert und bei der Degranulation freigesetzt wird. Mastzell-Tryptase ist an der proteolytischen Umgestaltung der extrazellulären Matrix beteiligt und kann über proteaseaktivierte Rezeptoren Signale vermitteln, wodurch Entzündungskaskaden, die Rekrutierung von Leukozyten und die Gefäßpermeabilität beeinflusst werden. Durch die Beeinflussung von Zytokinnetzwerken und der Dynamik des Gewebemikromilieus wird TPSAB1 in der Immunologie und der Biologie von Barrieregeweben häufig als Marker für Mastzellaktivierung und -häufigkeit verwendet. Veränderte Mastzell-Tryptase-Aktivität und Muster der Mastzellinfiltration werden bei Allergie, Asthma, chronisch-entzündlichen Erkrankungen, fibroseassoziierten Prozessen und tumorassoziierter Entzündung untersucht.

Mast Cell Tryptase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TPSAB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Mast Cell Tryptase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TPSAB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TPSAB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Mast Cell Tryptase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TPSAB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Mast Cell Tryptase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Mast Cell Tryptase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TPSAB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.