MARCH5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404655-ACT

MARCH5 (auch als MITOL bekannt) kodiert eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase der äußeren Mitochondrienmembran, die die Ubiquitinierung und den Proteinumsatz reguliert, um die mitochondriale Homöostase aufrechtzuerhalten. Durch die Koordination von mitochondrialer Dynamik, Qualitätskontrolle und Signalübertragung beeinflusst MARCH5 das Gleichgewicht zwischen Spaltung und Fusion und ist an stressresponsiven Signalwegen beteiligt, die sich mit Mitophagie und Apoptose überschneiden. Es moduliert die Stabilität zentraler mitochondrialer Proteine, die an Organellenmorphologie und Proteostase beteiligt sind, und prägt dadurch zelluläre Antworten auf oxidativen und proteotoxischen Stress. Eine dysregulierte MARCH5-Aktivität wurde mit veränderter mitochondrialer Funktion in der Krebsbiologie sowie mit zellulären Phänotypen in Verbindung gebracht, die mit Neurodegeneration assoziiert sind, was es zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien mitochondrialer Signalnetzwerke macht.

MARCH5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MARCH5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MARCH5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MARCH5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MARCH5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MARCH5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MARCH5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MARCH5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MARCH5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MARCH5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.