MAK CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421549-ACT

Das Mausgen *Mak* kodiert die male germ cell–associated kinase (MAK), eine Serin/Threonin-Kinase, die zur Kontrolle des Zellzyklus und zu Differenzierungsprogrammen beiträgt und dabei eine besonders wichtige Rolle in der Zilienbiologie spielt. Die MAK-Aktivität wurde mit der Regulation des mitotischen Fortschreitens sowie mit phosphorylierungsabhängigen Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, die die Organisation von Mikrotubuli und die Funktion des Zentrosoms beeinflussen. In differenzierten Zellen ist MAK an der Regulation der Länge der primären Zilie und am ziliären Transport beteiligt – Prozesse, die Signaltransduktionswege wie den Hedgehog-Signalweg prägen. Eine Fehlregulation MAK-assoziierter Signalwege wurde im Zusammenhang mit proliferativen Phänotypen sowie mit zilienabhängigen Defekten der Entwicklung und der Gewebehomöostase untersucht, was ihre Relevanz für mechanistische Krankheitsmodelle unterstreicht.

MAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Mak-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Mak-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Mak-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MAK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Mak-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MAK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MAK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Mak-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.