Plasmide CRISPR d'Activation (h) MAD1: sc-401885-ACT

Le gène humain **MAD1L1** code la protéine *Mitotic Arrest Deficient 1* (MAD1), un composant central du point de contrôle d’assemblage du fuseau (spindle assembly checkpoint, SAC) qui sécurise la ségrégation des chromosomes en surveillant l’attachement kinétochore–microtubules. MAD1 coopère avec MAD2 et d’autres facteurs du point de contrôle pour favoriser la formation du complexe de contrôle mitotique (MCC) et inhiber l’activité de l’APC/C-CDC20 jusqu’à l’obtention d’une bi-orientation correcte, limitant ainsi l’aneuploïdie et l’instabilité chromosomique. Par ses rôles dans le timing mitotique et la signalisation du point de contrôle, MAD1L1 est fréquemment étudié dans les voies reliant le maintien du génome à la progression du cycle cellulaire. Une dérégulation du contrôle checkpoint associé à MAD1L1 a été impliquée dans des phénotypes d’instabilité chromosomique observés dans de multiples contextes cancéreux et dans des modèles de fidélité mitotique altérée.

MAD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAD1L1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MAD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAD1L1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAD1L1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MAD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAD1L1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MAD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MAD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MAD1L1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.