Plasmide CRISPR d'Activation (h) mAChR M4: sc-402318-ACT

CHRM4 code le récepteur muscarinique humain de l’acétylcholine M4 (mAChR M4), un RCPG couplé à Gi/o qui module l’excitabilité neuronale et la transmission synaptique en inhibant l’adénylate cyclase, en réduisant la signalisation via l’AMPc et en régulant l’activité des canaux ioniques. M4 participe aux voies de neurotransmission cholinergique et module la sortie des circuits dopaminergiques via des mécanismes de signalisation présynaptiques et postsynaptiques. Les effets en aval incluent la modulation de la signalisation MAPK/ERK, de la dynamique du calcium et de la libération des neurotransmetteurs, reliant l’activité de CHRM4 à un contrôle, à l’échelle des réseaux, des processus moteurs et cognitifs. Des altérations de la signalisation des récepteurs muscariniques et une dérégulation des circuits associée à CHRM4 ont été étudiées dans le cadre de recherches sur les troubles neuropsychiatriques et les troubles du mouvement, notamment dans des contextes pertinents pour la schizophrénie, les circuits parkinsoniens et des phénotypes liés à l’usage de substances.

mAChR M4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHRM4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

mAChR M4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHRM4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHRM4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de mAChR M4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHRM4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de mAChR M4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie mAChR M4 dans les cellules tumorales présentant une expression de CHRM4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.