Limd1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424343-ACT

Mouse LIM Domain Containing 1 (Limd1) kodiert ein LIM-Domänen-Adapterprotein, das an Adhäsions- und Zytoskelettkomplexen lokalisiert und zur Organisation fokaler Adhäsionen sowie zur Aktindynamik beiträgt. LIMD1 ist an der Signalintegration an Zell–Matrix-Kontakten beteiligt und wurde mit der Regulation der Hippo-Signalwegaktivität durch Modulation der YAP/TAZ-Aktivität in Verbindung gebracht, wodurch Proliferation, Kontaktinhibition und Mechanotransduktion beeinflusst werden. Darüber hinaus ist es in Netzwerke der transkriptionellen Kontrolle sowie in stressresponsive Signalwege eingebunden, die den Verlauf des Zellzyklus und die Differenzierung mitbestimmen. Eine veränderte Expression oder Funktion von LIMD1 ist in mehreren krankheitsrelevanten Modellen mit dysregulierter Wachstumskontrolle und invasiven Phänotypen assoziiert, was Limd1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung tumorsuppressorähnlicher Signalwege und adhäsionsabhängiger Signalübertragung macht.

Limd1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Limd1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Limd1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Limd1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Limd1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Limd1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Limd1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Limd1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Limd1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Limd1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.