Plásmido CRISPR de Activación (m) LGR4: sc-430724-ACT

Lgr4 codifica el receptor acoplado a proteína G 4 que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR4), un receptor de membrana que potencia la señalización WNT/β-catenina mediante la unión a R-spondinas y la modulación de la actividad de RNF43/ZNRF3. En tejidos de ratón, LGR4 ayuda a regular el mantenimiento de células madre y progenitoras, las interacciones epitelio-mesénquima y la organogénesis, con efectos downstream sobre programas transcripcionales que controlan la proliferación y la diferenciación. La actividad de LGR4 se interseca con vías del desarrollo y de la homeostasis, incluida la comunicación cruzada con redes de señalización de factores de crecimiento e inflamación que determinan la remodelación tisular. La disfunción del eje LGR4–WNT se ha asociado con fenotipos relevantes para la biología ósea y reproductiva, el mantenimiento del epitelio intestinal y contextos de señalización asociados a tumores, lo que lo convierte en una diana útil para estudios mecanísticos de vías.

LGR4 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Lgr4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LGR4 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Lgr4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Lgr4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LGR4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Lgr4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LGR4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LGR4 en células tumorales con expresión de Lgr4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.