Plásmido CRISPR de Activación (h) LASS4: sc-406329-ACT

CERS4 (LASS4) codifica la ceramida sintasa 4, una enzima de membrana del retículo endoplásmico que acila bases esfingoides para generar especies específicas de ceramidas de cadena larga. Al controlar la composición de ceramidas, LASS4 influye en la organización de membranas y en procesos de señalización dependientes de esfingolípidos vinculados a la apoptosis, las respuestas al estrés celular y la homeostasis metabólica. Las alteraciones en la síntesis de ceramidas y en la remodelación de esfingolípidos se han asociado con una proliferación desregulada, inflamación y fenotipos neurometabólicos, lo que convierte a CERS4 en un nodo útil para estudiar la señalización lipídica y las vías de estrés de orgánulos. El análisis funcional de CERS4 respalda estudios mecanísticos sobre la regulación del destino celular impulsada por ceramidas, la función de barrera y la transducción de señales mediada por lípidos.

LASS4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CERS4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LASS4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CERS4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CERS4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LASS4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CERS4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LASS4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LASS4 en células tumorales con expresión de CERS4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.