LAR CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422521-ACT

Das Mausgen *Ptprf* kodiert die rezeptorartige Protein-Tyrosinphosphatase LAR (PTPRF), einen transmembranen Signalregulator, der phosphorylierungsabhängige Signalwege ausbalanciert, welche Zelladhäsion, Migration und Neuritenauswuchs steuern. LAR moduliert fokale Adhäsionen und die Dynamik des Zytoskeletts durch Wechselwirkungen mit Signalen aus der extrazellulären Matrix und intrazellulären Gerüstproteinen und beeinflusst dadurch integrin-gekoppelte Signalübertragung sowie die Signaloutputs von Wachstumsfaktorrezeptoren. In neuronalen und metabolischen Geweben wurde PTPRF/LAR mit der Organisation von Synapsen, der Axonführung und der Regulation der Insulinrezeptor-Signalgebung in Verbindung gebracht, was es für Studien zu neuroentwicklungsbedingten Phänotypen und Mechanismen der Insulinsensitivität relevant macht. Eine fehlregulierte Phosphataseaktivität und veränderte Adhäsionssignale wurden zudem mit onkogenen Prozessen wie aberranter Proliferation und Invasion in Zusammenhang gebracht, was seine Nutzung als Knotenpunkt zur Analyse von Signalwegen unterstützt.

LAR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ptprf-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LAR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ptprf-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ptprf-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LAR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ptprf-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LAR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LAR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ptprf-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.