Kremen-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403791-ACT

Das humane KREMEN1 kodiert Kremen-1, einen Single-Pass-Transmembranrezeptor, der als hochaffiner Bindungspartner für Dickkopf-(DKK-)Proteine dient und mit LRP5/6 kooperiert, um die kanonische Wnt/β-Catenin-Signalübertragung zu modulieren. Durch die Förderung der DKK-abhängigen Internalisierung von LRP6 beeinflusst Kremen-1 Zellschicksalsentscheidungen, Proliferations- und Differenzierungsprogramme, mit nachgeschalteten Effekten auf die Gewebemusterbildung und die epithelial–mesenchymale Dynamik. Die KREMEN1-Aktivität überschneidet sich mit Prozessen des Rezeptortransports und der Endozytose, die Signalstärke und -dauer an der Zelloberfläche prägen. Eine dysregulierte Modulation des Wnt-Signalwegs unter Beteiligung von Kremen-1 wurde mit Entwicklungsphänotypen sowie mit krebsassoziierten Signalkontexten in Verbindung gebracht, in denen Wnt-Ansprechbarkeit und Rezeptorverfügbarkeit verändert sind.

Kremen-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KREMEN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Kremen-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KREMEN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KREMEN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Kremen-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KREMEN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Kremen-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Kremen-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KREMEN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.