Plasmide CRISPR d'Activation (h) Klotho: sc-400970-ACT

KL code la protéine Klotho, une protéine transmembranaire de type I qui agit comme co‑récepteur obligatoire de la signalisation endocrine des FGF, en particulier de FGF23, afin de réguler l’homéostasie du phosphate et de la vitamine D. La forme membranaire de Klotho module également plusieurs nœuds de signalisation, notamment les voies insulin/IGF‑1, Wnt/β‑caténine et TGF‑β, influençant les réponses au stress oxydatif, la sénescence cellulaire et le remodelage de la matrice extracellulaire. Un ectodomaine soluble de Klotho, généré par clivage (« shedding »), peut agir de manière paracrine/endocrine pour moduler l’activité des canaux ioniques et la signalisation des facteurs de croissance dans divers tissus. Une expression dérégulée de KL a été associée à des phénotypes liés au vieillissement et a été étudiée dans des contextes tels que la maladie rénale chronique, le remodelage cardiovasculaire, les dysfonctionnements métaboliques et la neurodégénérescence, comme lien mécanistique entre le métabolisme minéral et l’homéostasie tissulaire.

Klotho Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Klotho Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Klotho. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Klotho au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Klotho dans les cellules tumorales présentant une expression de KL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.