Plasmide CRISPR d'Activation (h) KIR6.1: sc-401477-ACT

KCNJ8 code la sous-unité de canal potassique à rectification entrante KIR6.1, un composant central des canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP), qui couplent l’état métabolique cellulaire à l’excitabilité membranaire. En complexe avec les sous-unités du récepteur aux sulfonylurées (ABCC8/ABCC9), KIR6.1 régule l’efflux de potassium en fonction des rapports intracellulaires ATP/ADP, modulant ainsi le potentiel de membrane, l’entrée de calcium et les signalisations en aval qui contrôlent le tonus vasculaire et la contractilité du muscle lisse. Ces canaux sont essentiels aux mécanismes de détection métabolique et aux voies de réponse au stress dans des tissus excitables comme non excitables, influençant la fonction mitochondriale et la bioénergétique cellulaire. Une activité altérée de KCNJ8/KIR6.1 a été associée à des phénotypes cardiovasculaires et liés à l’excitabilité, ce qui souligne sa pertinence dans l’étude des canalopathies et des mécanismes des maladies cardiométaboliques.

KIR6.1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNJ8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KIR6.1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNJ8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNJ8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KIR6.1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNJ8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KIR6.1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KIR6.1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNJ8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.