Plasmide CRISPR d'Activation (m) KCNT1: sc-432714-ACT

Kcnt1 code pour le canal potassique KCNT1 de la souris, activé par le sodium, un canal K+ à grande conductance qui couple les augmentations intracellulaires de Na+ à la repolarisation membranaire et à l’adaptation de la fréquence de décharge des neurones. En modulant l’hyperpolarisation qui suit le potentiel d’action et la dynamique des salves, KCNT1 influence l’intégration synaptique et l’excitabilité des réseaux, en s’inscrivant à l’interface de voies régissant l’homéostasie ionique et la signalisation dépendante de l’activité. Une activité altérée de KCNT1 est associée à des phénotypes d’hyperexcitabilité neuronale et a été étudiée dans le contexte des mécanismes liés aux crises et aux troubles du neurodéveloppement, ce qui étaye sa pertinence dans les dysfonctionnements à l’échelle des circuits. Dans des modèles murins, Kcnt1 constitue un nœud expérimental accessible pour examiner comment les conductances KNa ajustent l’équilibre excitation–inhibition et la plasticité.

KCNT1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Kcnt1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KCNT1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Kcnt1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Kcnt1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KCNT1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Kcnt1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KCNT1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KCNT1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Kcnt1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.