KCC3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405975-ACT

SLC12A6 kodiert den Kalium-Chlorid-Kotransporter KCC3, ein Mitglied der Familie der Kationen-Chlorid-Kotransporter, der einen elektroneutralen Efflux von K+ und Cl− vermittelt, um das intrazelluläre Chlorid, das osmotische Gleichgewicht und das Zellvolumen zu regulieren. Die Aktivität von KCC3 trägt zur Aufrechterhaltung des Membranpotenzials und der neuronalen Erregbarkeit bei, indem sie Chloridgradienten formt, die die inhibitorische Neurotransmission beeinflussen, und wird durch phosphorylierungsabhängige Signalwege moduliert, die auf zellulären Stress und die Ionenhomöostase reagieren. Im Nervensystem unterstützt KCC3 die Integrität von Axonen und Myelin und ist an Reaktionen auf Zellschwellung und ionische Störungen beteiligt. Eine genetische Störung oder Fehlregulation von SLC12A6 ist mit neuroentwicklungsbedingten und neurodegenerativen Phänotypen assoziiert, darunter periphere Neuropathie und Weißsubstanzauffälligkeiten, was es für die Untersuchung von Ionentransport-Mechanismen in krankheitsrelevanten Zelltypen relevant macht.

KCC3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC12A6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KCC3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC12A6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC12A6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KCC3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC12A6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KCC3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KCC3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC12A6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.