Plasmide CRISPR d'Activation (h) IRSp53: sc-403072-ACT

BAIAP2 code pour IRSp53, une protéine adaptatrice qui relie la détection de la courbure membranaire au remodelage du cytosquelette d’actine via des interactions avec des GTPases de la famille Rho telles que Cdc42, des partenaires se liant au domaine SH3 et des complexes régulateurs de l’actine. IRSp53 contribue à la formation de filopodes et de lamellipodes, en coordonnant des processus tels que la migration cellulaire, la dynamique d’adhérence et la croissance des neurites. Par son rôle dans l’organisation du cytosquelette et le trafic membranaire, l’activité de BAIAP2 s’inscrit à l’interface de réseaux de signalisation qui régulent la morphologie épithéliale et neuronale. Dans des études mécanistiques, une dynamique de l’actine altérée dépendante d’IRSp53 a été associée à des phénotypes neurodéveloppementaux ainsi qu’à des modifications de la motilité cellulaire liées aux tumeurs.

IRSp53 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BAIAP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IRSp53 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BAIAP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BAIAP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IRSp53. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BAIAP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IRSp53 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IRSp53 dans les cellules tumorales présentant une expression de BAIAP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.