IRE1α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400576-ACT

ERN1 kodiert das Inositol-requiring Enzyme 1 alpha (IRE1α), eine im ER lokalisierte transmembrane Kinase/Endoribonuklease, die als zentraler Sensor für die Belastung durch fehlgefaltete Proteine fungiert und die unfolded protein response (UPR) einleitet. Bei ER-Stress oligomerisiert IRE1α und aktiviert seine RNase-Aktivität, um XBP1‑mRNA zu spleißen und adaptive Transkriptionsprogramme zu fördern; zugleich initiiert es den regulierten IRE1‑abhängigen Abbau (RIDD), um die mRNA‑Homöostase zu modulieren. Über Crosstalk mit PERK- und ATF6-Signalwegen koordiniert ERN1 Proteostase, Lipidstoffwechsel und inflammatorische Signalgebung und beeinflusst so Zellschicksalsentscheidungen zwischen Anpassung und Apoptose. Eine dysregulierte Aktivität der IRE1α–XBP1‑Achse wurde u. a. mit dem Überleben von Tumorzellen unter Stress, metabolischer Dysfunktion und Neurodegeneration in Verbindung gebracht, wodurch ERN1 ein häufig genutzter Knotenpunkt für mechanistische Studien der ER‑Stressbiologie ist.

IRE1α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ERN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IRE1α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ERN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ERN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IRE1α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ERN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IRE1α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IRE1α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ERN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.