IRAK-M CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403219-ACT

IRAK3 kodiert IRAK-M, einen in myeloiden Zellen angereicherten negativen Regulator der angeborenen Immunantwort, der Toll-like-Rezeptor- und IL‑1‑Rezeptor-Kaskaden abschwächt, indem er die IRAK1/IRAK4-abhängige Signalweiterleitung vom MyD88-Komplex aus begrenzt. Durch die Einschränkung der nachgeschalteten NF‑κB- und MAPK-Aktivierung trägt IRAK-M dazu bei, Zytokin- und Chemokinprofile zu formen, und unterstützt Endotoxin-Toleranz sowie die Auflösung entzündlicher Reaktionen. Eine veränderte IRAK3-Expression wurde mit fehlregulierter Entzündungssignalgebung in Makrophagen und Monozyten in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext chronischer Entzündung, Immunsuppression und pathogenvermittelter Immunflucht untersucht. Diese Eigenschaften machen IRAK-M zu einem nützlichen Knotenpunkt, um Rückkopplungskontrolle in angeborenen Immunwegen und Transkriptionsprogrammen zu analysieren, die mit Zustandsübergängen myeloider Zellen einhergehen.

IRAK-M Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IRAK3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IRAK-M Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IRAK3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IRAK3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IRAK-M-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IRAK3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IRAK-M-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IRAK-M-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IRAK3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.