IPP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402634-ACT

PPP1R1A kodiert den Inhibitor der Proteinphosphatase 1 (IPP-1), einen durch Phosphorylierung regulierten Modulator, der an die katalytische Untereinheit von PP1 bindet und deren Aktivität hemmt, um Ausmaß und zeitlichen Verlauf der Serin/Threonin-Dephosphorylierung zu steuern. Durch die Integration von Signalen aus cAMP/PKA- und weiteren Kinasewegen beeinflusst IPP-1 phosphorylierungsabhängige Prozesse, darunter die Regulation von Ionenkanälen, die Zytoskelettdynamik und die Transkriptionskontrolle. Die Aktivität von PPP1R1A ist über die Kontrolle PP1-abhängiger Substrate mit neuronaler Signalübertragung und synaptischer Plastizität verknüpft, und eine veränderte Phosphatasehemmung wurde mit fehlregulierter Signalgebung in neuropsychiatrischen und neurodegenerativen Zusammenhängen in Verbindung gebracht. Als Knotenpunkt im Gleichgewicht zwischen Phosphatasen und Kinasen bietet PPP1R1A einen gut handhabbaren Ansatz, um Phosphorylierungsnetzwerke und das nachgelagerte Umlenken von Signalwegen zu untersuchen.

IPP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP1R1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IPP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP1R1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP1R1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IPP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP1R1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IPP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IPP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP1R1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.