Plásmido CRISPR de Activación (h) IP3R-III: sc-402138-ACT

ITPR3 codifica el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 3 (IP3R-III), un canal de liberación de Ca²⁺ del retículo endoplásmico que se abre en respuesta al IP3 generado aguas abajo de la señalización de la fosfolipasa C. Al modular las oscilaciones intracelulares de Ca²⁺ y la señalización en microdominios, IP3R-III regula la secreción, la polaridad epitelial, el metabolismo mitocondrial y programas de transcripción dependientes de Ca²⁺. La función de IP3R-III se intersecta con las vías de los GPCR y de las tirosina quinasas receptoras, acoplando señales extracelulares a la dinámica de Ca²⁺ del RE y a efectores posteriores como las quinasas dependientes de calmodulina y la señalización de NFAT. La alteración de la expresión de ITPR3 o de la homeostasis de Ca²⁺ se ha asociado con proliferación desregulada, respuestas al estrés y remodelación epitelial en múltiples contextos relevantes para la enfermedad, lo que respalda estudios mecanísticos de las redes de señalización de Ca²⁺.

IP3R-III El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ITPR3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

IP3R-III El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ITPR3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ITPR3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de IP3R-III. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ITPR3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de IP3R-III en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía IP3R-III en células tumorales con expresión de ITPR3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.