Plasmide CRISPR d'Activation (m) IP3R-I: sc-421192-ACT

Le gène murin *Itpr1* code le récepteur de l’inositol 1,4,5-trisphosphate de type 1 (IP3R-I), un canal de libération de Ca2+ du réticulum endoplasmique qui convertit les signaux IP3 générés par la PLC en transitoires de calcium cytosoliques et organellaires. IP3R-I régule le couplage excitation–transcription, la plasticité synaptique et le métabolisme mitochondrial dépendant du Ca2+, en modulant la signalisation en aval via les voies CaMK, calcineurine–NFAT et MAPK. Dans les neurones et d’autres types cellulaires excitables, les dynamiques calciques induites par IP3R-I influencent l’intégration dendritique et l’homéostasie des circuits, tandis que leur dérégulation perturbe les réponses au stress cellulaire et les programmes d’expression génique dépendants du calcium. Des altérations génétiques et fonctionnelles d’*ITPR1* sont associées à des dysfonctionnements cérébelleux et à des phénotypes neurodégénératifs dans des systèmes modèles, ce qui souligne sa pertinence pour l’étude des mécanismes de signalisation calcique dans des contextes liés aux maladies.

IP3R-I Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Itpr1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IP3R-I Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Itpr1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Itpr1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IP3R-I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Itpr1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IP3R-I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IP3R-I dans les cellules tumorales présentant une expression de Itpr1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.