Plasmide CRISPR d'Activation (h) IKK alpha: sc-400492-ACT

CHUK code pour IKK alpha (IKKα), une sous-unité catalytique du complexe kinase IκB, qui intègre des signaux en amont provenant des voies du récepteur du TNF, des récepteurs de type Toll (TLR) et des récepteurs de l’antigène afin de réguler les programmes transcriptionnels de NF-κB. IKKα est indispensable à la voie non canonique de NF-κB via la phosphorylation de NFKB2/p100 et soutient la signalisation p52–RelB, qui influence l’organogenèse des tissus lymphoïdes, la différenciation des cellules immunitaires et l’expression des gènes inflammatoires. Au-delà de NF-κB, IKKα participe à des interactions (crosstalk) avec les voies MAPK et les voies liées à l’interféron, et a été associée à des fonctions liées à la chromatine affectant le contrôle transcriptionnel. Une activité dérégulée de CHUK/IKKα est associée à une inflammation aberrante, à des dysfonctionnements immunitaires et à des réseaux de signalisation pertinents pour le cancer, ce qui en fait une cible fréquente d’études mécanistiques sur la régulation des voies et la transcription en réponse au stress.

IKK alpha Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHUK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IKK alpha Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHUK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHUK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IKK alpha. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHUK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IKK alpha au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IKK alpha dans les cellules tumorales présentant une expression de CHUK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.