Plasmide CRISPR d'Activation (h) IDH3A: sc-404788-ACT

IDH3A code la sous-unité alpha de l’isocitrate déshydrogénase mitochondriale 3, une enzyme dépendante du NAD+ qui catalyse la décarboxylation oxydative de l’isocitrate en α‑cétoglutarate dans le cycle des acides tricarboxyliques (cycle de Krebs, TCA). En régulant la production mitochondriale de NADH, IDH3A soutient la phosphorylation oxydative, l’équilibre rédox et le couplage métabolique entre la glycolyse et les voies biosynthétiques. Des altérations de l’activité et de l’expression d’IDH3A ont été associées à une reprogrammation métabolique, à un dysfonctionnement mitochondrial et à des phénotypes prolifératifs, ce qui en fait un nœud pertinent pour l’étude du métabolisme énergétique et des réponses au stress. Les voies associées à IDH3A recoupent la signalisation de l’hypoxie, la gestion des espèces réactives de l’oxygène et le flux de carbone vers des substrats anaplérotiques et épigénétiques dérivés de l’α‑cétoglutarate.

IDH3A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de IDH3A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IDH3A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus IDH3A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription IDH3A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IDH3A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus IDH3A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IDH3A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IDH3A dans les cellules tumorales présentant une expression de IDH3A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.