Id4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401380-ACT

ID4 (inhibitor of DNA binding 4) kodiert einen Helix-Loop-Helix-(HLH)-Transkriptionsregulator, dem eine basische DNA-Bindedomäne fehlt und der die Genexpression moduliert, indem er E‑Proteine und andere bHLH‑Faktoren sequestriert. Über diese Interaktionen beeinflusst Id4 die Festlegung von Zellschicksalen (lineage commitment), die Differenzierung und die Kontrolle des Zellzyklus und verknüpft damit entwicklungsbezogene Transkriptionsprogramme mit Chromatin- und Signaltransduktionssignalen. Die ID4‑Aktivität wurde mit Prozessen wie Neurogenese, Gliaentwicklung und epithelialer Differenzierung in Verbindung gebracht, bei denen sie das Gleichgewicht zwischen proliferativen und differenzierten Zuständen mitbestimmen kann. Eine fehlregulierte ID4‑Expression wurde in mehreren krankheitsassoziierten Kontexten beschrieben, darunter krebsrelevante epigenetische Veränderungen und abnorme Differenzierungsphänotypen, was ID4 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Transkriptionskontrolle macht.

Id4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ID4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Id4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ID4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ID4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Id4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ID4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Id4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Id4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ID4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.