I1PP2A CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419111-ACT

Mouse Anp32a codiert I1PP2A, ein nukleäres, saures, leucinreiches Phosphoprotein, das als Inhibitor und Modulator der Proteinphosphatase 2A (PP2A) wirkt und dadurch phosphorylierungsabhängige Signalnetzwerke beeinflusst. Über die Regulation von PP2A sowie chromatinassoziierte Aktivitäten trägt ANP32A zur Kontrolle der Zellzyklusprogression, von DNA-Schadensantworten und von Transkriptionsprogrammen bei, die mit Differenzierung und Stressadaptation verknüpft sind. Zudem wurde es mit der Regulation der Apoptose und einer umfassenderen RNA- und Proteinhomöostase durch Interaktionen mit nukleären Komplexen in Verbindung gebracht. Eine Fehlregulation der ANP32A/I1PP2A-Aktivität und veränderte PP2A-Signalgebung sind relevant für Studien zu onkogenen Kinase-Signalwegen, zur Neurobiologie sowie zu entzündlichen oder stressassoziierten Phänotypen, bei denen das Gleichgewicht von Phosphatasen zelluläre Ergebnisse maßgeblich prägt.

ANP32A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Anp32a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANP32A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Anp32a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Anp32a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANP32A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Anp32a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANP32A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANP32A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Anp32a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.