Plasmide CRISPR d'Activation (h) HVEM: sc-402104-ACT

TNFRSF14 code HVEM (Herpesvirus Entry Mediator), un membre de la superfamille des récepteurs du TNF qui intègre à la surface cellulaire des signaux immunitaires à la fois stimulateurs et inhibiteurs. HVEM interagit avec plusieurs ligands, dont LIGHT (TNFSF14), BTLA et CD160, afin de moduler des programmes transcriptionnels associés à NF-κB et aux MAPK, qui orientent l’activation des lymphocytes T, la production de cytokines et l’homéostasie immunitaire. Via des interactions avec des voies de costimulation et de points de contrôle immunitaires, HVEM contribue à la régulation du trafic lymphocytaire et des réponses inflammatoires dans divers contextes tissulaires. Une dérégulation de la signalisation de HVEM a été impliquée dans l’inflammation à médiation immunitaire et dans les interactions tumeur–système immunitaire, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques de l’immunorégulation et de la signalisation du microenvironnement.

HVEM Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFRSF14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HVEM Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFRSF14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFRSF14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HVEM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFRSF14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HVEM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HVEM dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFRSF14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.