Plasmide CRISPR d'Activation (h) Hus1: sc-403287-ACT

HUS1 humain code Hus1, un composant central de la pince de point de contrôle 9-1-1 (RAD9A–RAD1–HUS1), chargée sur l’ADN endommagé afin de coordonner la surveillance du génome. Ce complexe favorise la signalisation dépendante d’ATR, soutient la stabilisation des fourches de réplication et facilite le choix des voies de réparation de l’ADN via des interactions avec des médiateurs tels que TOPBP1 et de multiples facteurs de réparation. En reliant la détection des dommages à l’ADN au contrôle des points de contrôle du cycle cellulaire, Hus1 contribue à limiter l’instabilité génomique associée à la réplication. La dérégulation des processus de point de contrôle 9-1-1/ATR est fréquemment étudiée dans le contexte de la charge mutationnelle, des phénotypes d’instabilité chromosomique et des défauts de la réponse aux dommages de l’ADN, pertinents pour la biologie du cancer et les troubles héréditaires de maintenance du génome.

Hus1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HUS1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Hus1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HUS1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HUS1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Hus1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HUS1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Hus1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Hus1 dans les cellules tumorales présentant une expression de HUS1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.