HSP70-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418088-ACT

HSPA1A codiert das induzierbare molekulare Chaperon HSP70-1, eine zentrale Komponente der zellulären Hitzeschockantwort, die die Proteostase bei thermischem, oxidativem und proteotoxischem Stress aufrechterhält. HSP70-1 bindet freiliegende hydrophobe Bereiche neu synthetisierter oder fehlgefalteter Proteine, um deren Refaltung zu fördern, Aggregation zu verhindern und gemeinsam mit Co-Chaperonen sowie den Ubiquitin‑Proteasom- und Autophagie‑Signalwegen Entscheidungen über deren weiteres Schicksal zu koordinieren. Dieses stressadaptive Netzwerk überschneidet sich mit der Proteinkontrolle (Protein Quality Control), der Regulation der Apoptose, inflammatorischer Signalgebung sowie der Erholung von Stress des endoplasmatischen Retikulums und der Mitochondrien. Eine fehlregulierte Expression von HSPA1A/HSP70-1 wird häufig im Zusammenhang mit Proteinfehlfaltungs-Erkrankungen, Ischämie‑Reperfusionsschäden und der Stresstoleranz von Tumorzellen untersucht, da eine veränderte Chaperon-Kapazität die zelluläre Widerstandsfähigkeit und Signalzustände neu ausprägen kann.

HSP70-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSPA1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSP70-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSPA1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSPA1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSP70-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSPA1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSP70-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSP70-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSPA1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.