HSP70-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418088-ACT

HSPA1A codifica a chaperona molecular induzível HSP70-1, um componente central da resposta celular ao choque térmico que preserva a proteostase durante estresse térmico, oxidativo e proteotóxico. A HSP70-1 liga-se a regiões hidrofóbicas expostas de proteínas nascentes ou mal dobradas para promover o redobramento, prevenir a agregação e coordenar decisões de triagem com co-chaperonas e com as vias ubiquitina–proteassoma e de autofagia. Essa rede adaptativa ao estresse se cruza com o controle de qualidade proteica, a regulação da apoptose, a sinalização inflamatória e a recuperação do estresse do retículo endoplasmático e das mitocôndrias. A expressão desregulada de HSPA1A/HSP70-1 é frequentemente estudada em contextos de doenças associadas ao mau dobramento de proteínas, lesão por isquemia-reperfusão e tolerância de células tumorais ao estresse, nos quais alterações na capacidade de chaperonas podem remodelar a resiliência celular e os estados de sinalização.

HSP70-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HSPA1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HSP70-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HSPA1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HSPA1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HSP70-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HSPA1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HSP70-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HSP70-1 em células tumorais com expressão de HSPA1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.