HSF4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403850-ACT

Humanes HSF4 (Heat-Shock-Transkriptionsfaktor 4) ist ein DNA-bindender Transkriptionsfaktor, der stressresponsive Genexpressionsprogramme reguliert, darunter molekulare Chaperone und Komponenten der Proteostase, die die Proteinfaltung und die zelluläre Homöostase sichern. Im Unterschied zu klassischen, durch Hitze induzierbaren HSFs trägt HSF4 zur entwicklungs- und differenzierungsassoziierten transkriptionellen Kontrolle bei, mit wichtigen Funktionen in der Biologie der Augenlinse und der Aufrechterhaltung ihrer Transparenz. Durch die Modulation von Promotoren, die Heat-Shock-Elemente (HSE) enthalten, verknüpft HSF4 proteotoxische Stressantworten, Proteinkontrolle/-qualitätskontrolle und Zellzustandsübergänge. Fehlregulierte HSF4-Aktivität und Varianten wurden mit Linsenveränderungen und kataraktassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, was HSF4 für Studien zur Proteinaggregation, epithelialen Differenzierung und gewebespezifischen Transkriptionsnetzwerken relevant macht.

HSF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSF4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSF4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSF4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSF4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSF4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSF4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSF4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSF4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.