HNF-3α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400743-ACT

FOXA1 (HNF-3α) ist ein Pioneer-Transkriptionsfaktor der Forkhead-Familie, der an kompaktes Chromatin bindet, um zugängliche regulatorische Landschaften zu etablieren und linien-/gewebespezifische Genexpressionsprogramme zu koordinieren. In humanen Epithelgeweben verknüpft er die Signalübertragung von Hormonrezeptoren mit Transkriptionsnetzwerken, die Differenzierung, Stoffwechsel und Zellzyklusprogression steuern, einschließlich umfangreicher Wechselwirkungen mit nuklearen Rezeptorwegen wie der Östrogen- und Androgenrezeptor-abhängigen Transkription. Die FOXA1-Aktivität beeinflusst die Enhancer-Auswahl und das Chromatin-Remodeling und prägt dadurch Entwicklungs- und Homöostaseprozesse in Leber, Lunge, Pankreas und dem Mammaryepithel. Eine fehlregulierte FOXA1-Expression oder veränderte Chromatin-Bindungsprofile werden häufig in hormongetriebenen Krebserkrankungen und anderen Krankheiten untersucht, die durch eine gestörte epitheliale Identität und transkriptionelle Reprogrammierung gekennzeichnet sind.

HNF-3α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FOXA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HNF-3α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FOXA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FOXA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HNF-3α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FOXA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HNF-3α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HNF-3α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FOXA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.