hippocalcin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420938-ACT

Hpca kodiert Hippocalcin, ein in Neuronen angereichertes EF-Hand-Calciumbindeprotein, das als Calciumsensor fungiert und aktivitätsabhängige Ca2+-Transienten mit nachgeschalteter Signalübertragung verknüpft. Hippocalcin ist an Mechanismen der synaptischen Plastizität beteiligt, indem es Ca2+-regulierte Proteininteraktionen moduliert, die Membranassoziation über einen Myristoyl-Schalter steuert und endozytosebezogene Prozesse beeinflusst, die die Neurotransmission formen. In Schaltkreisen des Mausgehirns ist die Hpca-Expression mit der Regulation der neuronalen Erregbarkeit und langfristigen synaptischen Veränderungen verbunden, wodurch sie mit Signalwegen verknüpft ist, die Lernen und Gedächtnis beeinflussen. Eine gestörte Calciumhomöostase und synaptische Signalübertragung deuten darauf hin, dass hippocalcinbezogene Netzwerke an neurodegenerativen sowie neuropsychiatrisch relevanten Phänotypen beteiligt sind, die in mechanistischen Forschungsmodellen untersucht werden.

hippocalcin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Hpca-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

hippocalcin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Hpca-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Hpca-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen hippocalcin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Hpca-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von hippocalcin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des hippocalcin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Hpca-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.