HIP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402515-ACT

Humanes HIP1 (Huntingtin-interagierendes Protein 1) ist ein endozytotischer Adapter, der Komponenten clathrinbeschichteter Gruben mit Aktin und Cargo-Rezeptoren verknüpft und so die Vesikelbildung sowie den intrazellulären Transport unterstützt. Über Interaktionen mit Clathrin, AP2 und phosphoinositidreichen Membranen beeinflusst HIP1 die Rezeptorinternalisierung und die nachgeschaltete Signaldynamik, einschließlich Signalwege, die mit dem Turnover von Wachstumsfaktorrezeptoren verbunden sind. Eine veränderte HIP1-Expression oder Fusionsereignisse wurden mit dysregulierter Signalübertragung und Phänotypen erhöhter Zellproliferation in Zusammenhang gebracht, was HIP1 für Studien zur onkogenen Transformation und zu Defekten der Membrantrafik relevant macht. HIP1 wird zudem als Marker in Untersuchungen zur Zytoskelettorganisation und Proteostase verwendet, insbesondere in Kontexten, in denen endozytoseabhängige Signalgebung gestört ist.

HIP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HIP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HIP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HIP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HIP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HIP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HIP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HIP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HIP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HIP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.