HiNF-P CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-416760-ACT-2

Das humane Gen HINFP kodiert den Transkriptionsfaktor HiNF-P, einen sequenzspezifischen Regulator, der den Eintritt in die S-Phase koordiniert, indem er die Expression der Histon-H4-Gene aktiviert und während der DNA-Replikation den Chromatinaufbau fördert. HiNF-P wirkt an der Zellzykluskontrolle über Interaktionen mit E2F/RB-gekoppelten Regulationsnetzwerken mit und trägt zur Genomstabilität bei, indem er eine rechtzeitige Nukleosomenablagerung und die replikationsgekoppelte Chromatinaufrechterhaltung unterstützt. Eine Fehlregulation der mit HINFP verbundenen Transkriptionsprogramme wurde mit aberranter Proliferation und veränderten epigenetischen Zuständen in Verbindung gebracht, wie sie bei Krebs und anderen Erkrankungen mit gestörtem Zellzyklusgleichgewicht beobachtet werden. Geneditierung von HINFP in humanen Zellmodellen ermöglicht mechanistische Untersuchungen der Histongenregulation, von Replikationsstressantworten und der Chromatindynamik und unterstützt dadurch die Kartierung von Signalwegen sowie funktionelle Genomik-Analysen.

HiNF-P Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HINFP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HiNF-P Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HINFP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HINFP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HiNF-P-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HINFP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HiNF-P-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HiNF-P-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HINFP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.