Plasmide CRISPR d'Activation (h) HFE: sc-403695-ACT

HFE code une protéine de type complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I, qui s’associe à la β2‑microglobuline et module les interactions avec le récepteur de la transferrine (TFRC) afin de réguler la captation cellulaire du fer et l’homéostasie systémique du fer. Par son influence sur la signalisation de l’hepcidine (HAMP) et sur la détection du fer dans les hépatocytes et les macrophages, HFE affecte le stockage de la ferritine, la saturation de la transferrine et les réponses au stress oxydatif. Une fonction HFE dérégulée est associée à des phénotypes de surcharge en fer ainsi qu’à une altération des signalisations inflammatoires et métaboliques dans les tissus sensibles aux déséquilibres rédox. En recherche, HFE constitue un nœud expérimentalement accessible pour étudier des voies dépendantes du fer influençant la fonction mitochondriale, le métabolisme lipidique et le comportement des cellules immunitaires.

HFE Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HFE sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HFE Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HFE dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HFE, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HFE. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HFE natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HFE au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HFE dans les cellules tumorales présentant une expression de HFE silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.