HECTD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409864-ACT

HECTD1 kodiert eine HECT-Domäne-enthaltende E3-Ubiquitin-Ligase, die die Ubiquitinierung von Substraten vermittelt und dadurch den Proteinumsatz sowie die Dynamik von Signalwegen steuert. Durch die Regulation der ubiquitinabhängigen Proteostase beeinflusst HECTD1 zelluläre Prozesse wie die Progression des Zellzyklus, den Umbau des Zytoskeletts und stressresponsive Signalwege, die Zellschicksalsentscheidungen prägen. Eine Störung der Ubiquitin-Ligase-Aktivität wurde mit veränderter inflammatorischer Signalgebung und Entwicklungsphänotypen in Verbindung gebracht, wodurch HECTD1 einen relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung von Pathway-Rewiring in krankheitsassoziierten Kontexten darstellt. Als Regulator von Netzwerken posttranslationaler Modifikationen bietet HECTD1 einen mechanistischen Ansatzpunkt, um Beiträge des Ubiquitin-Systems zu Transkriptionsprogrammen und zur zellulären Homöostase zu analysieren.

HECTD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HECTD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HECTD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HECTD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HECTD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HECTD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HECTD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HECTD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HECTD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HECTD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.