HDMCP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-415327-ACT

O SLC25A47 humano codifica o transportador da membrana interna mitocondrial HDMCP, um membro da família de transportadores de solutos implicado no controlo da troca de metabolitos mitocondriais e da eficiência respiratória. A atividade do HDMCP está associada à regulação da fosforilação oxidativa, do potencial de membrana mitocondrial e de programas mais amplos de homeostase energética que coordenam a utilização de nutrientes em tecidos metabolicamente ativos. A expressão alterada de transportadores mitocondriais, incluindo o HDMCP, tem sido associada a desregulação do metabolismo de lípidos e da glicose, stress oxidativo e alterações de sinalização que influenciam a adaptação celular às exigências energéticas. Como resultado, o SLC25A47 é de interesse para o estudo da bioenergética mitocondrial, da remodelação de vias metabólicas e de mecanismos que ligam a função mitocondrial a fenótipos relevantes para doenças.

HDMCP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC25A47 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HDMCP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC25A47 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC25A47, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HDMCP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC25A47 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HDMCP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HDMCP em células tumorais com expressão de SLC25A47 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.