Haspin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403076-ACT

GSG2 kodiert die Serin/Threonin-Kinase Haspin, einen mitotischen Regulator, der Histon H3 an Thr3 phosphoryliert und dadurch während der Prometaphase und Metaphase eine Andockplattform für den Chromosomal Passenger Complex (CPC) schafft. Diese epigenetische Markierung fördert die Anreicherung der Aurora‑B-Signalgebung am Zentromer und trägt zu einer korrekten Chromosomenausrichtung, zu einer geregelten Kohäsionsdynamik sowie zur präzisen Segregation während der Zellteilung bei. Durch die Einbindung in die Kontrolle des mitotischen Checkpoints und in chromatinbasierte Signalwege verknüpft Haspin die Histonphosphorylierung mit der Kinetochor-Funktion und der Organisation des Spindelapparats. Eine fehlregulierte Haspin-Aktivität wurde mit proliferativen Phänotypen und genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, wodurch GSG2 einen geeigneten Ansatzpunkt darstellt, um zellzyklusabhängige Chromatinregulation in krebsrelevanten Kontexten zu untersuchen.

Haspin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GSG2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Haspin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GSG2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GSG2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Haspin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GSG2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Haspin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Haspin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GSG2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.