Plasmide CRISPR d'Activation (h) GW182: sc-400906-ACT

Le gène humain TNRC6A code GW182, une protéine d’échafaudage centrale des GW/P-bodies qui couple les microARN liés à Argonaute au silençage génique post‑transcriptionnel. GW182 interagit avec les complexes de déadénylation CCR4–NOT et PAN2–PAN3 afin de favoriser la déadénylation des ARNm, leur décoiffage et leur dégradation, et contribue également à la répression de la traduction des transcrits cibles. Par ces activités, TNRC6A participe à façonner des programmes d’expression génique impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, la différenciation et les réponses au stress. La dérégulation du silençage médié par les microARN et de la dynamique des P-bodies a été associée à la signalisation oncogénique, à des phénotypes neurodéveloppementaux et à des processus liés à l’immunité, faisant de TNRC6A un nœud utile pour des études mécanistiques de la régulation de l’ARN.

GW182 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNRC6A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GW182 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNRC6A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNRC6A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GW182. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNRC6A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GW182 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GW182 dans les cellules tumorales présentant une expression de TNRC6A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.