G_{α 14} CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404556-ACT

GNA14 kodiert die menschliche heterotrimere G‑Protein‑α‑Untereinheit Gα14, ein Mitglied der Gq/11‑Familie, die aktivierte GPCRs an die Phospholipase‑C‑β‑Signalgebung koppelt. Nach Rezeptoraktivierung fördert Gα14 die Hydrolyse von PIP2 zur Bildung von IP3 und DAG, was die Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+, die Aktivierung der Proteinkinase C und nachgeschaltete Transkriptionsprogramme auslöst, die mit Sekretion, Kontraktion glatter Muskulatur und der Signalübertragung in Immunzellen verbunden sind. Diese Achse überschneidet sich mit MAPK‑ und Rho‑GTPase‑Signalwegen, die Proliferation, Zytoskelett‑Remodellierung und Zellmigration koordinieren. Eine dysregulierte GPCR‑Gq‑Signalgebung unter Beteiligung von GNA14 wurde mit veränderten Signalzuständen in proliferativen und entzündlichen Kontexten in Verbindung gebracht, was seine Untersuchung in krankheitsrelevanten Zellmodellen unterstützt.

Gα 14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GNA14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gα 14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GNA14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GNA14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gα 14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GNA14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gα 14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gα 14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GNA14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.