GRB14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405224-ACT

GRB14 (growth factor receptor-bound protein 14) ist ein Adapterprotein, das an aktivierte Rezeptor-Tyrosinkinasen bindet und die nachgeschaltete Signaltransduktion moduliert; seine gut charakterisierten Interaktionen beeinflussen insbesondere die Signalwege des Insulinrezeptors und von IGF1R. Durch die Einbindung in Signalkomplexe an der Plasmamembran kann GRB14 den Output der PI3K–AKT- und MAPK-Signalwege beeinflussen und damit Programme für zellulären Stoffwechsel, Proliferation und Überleben prägen. Eine veränderte GRB14-Expression oder -Aktivität wurde mit fehlregulierter Insulinsignalgebung und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht; aufgrund seiner Position im Signalnetzwerk ist GRB14 zudem relevant für wachstumsfaktorabhängige Zellzustände, wie sie in der Krebsbiologie untersucht werden. Die experimentelle Modulation von GRB14 unterstützt mechanistische Arbeiten zu rezeptorproximaler Signalgebung, Feedback-Kontrolle und Pathway-Crosstalk in humanen Zellmodellen.

GRB14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GRB14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRB14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GRB14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GRB14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRB14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GRB14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRB14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRB14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GRB14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.