Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPR116: sc-408424-ACT

ADGRF5 (GPR116) est un récepteur d’adhésion couplé aux protéines G (RCPG) doté d’un large domaine N-terminal extracellulaire et d’un site de protéolyse propre aux RCPG, qui relie les interactions avec la matrice extracellulaire et les contacts cellule–cellule à la signalisation intracellulaire. Il est exprimé dans les compartiments épithélial et endothélial, notamment dans le poumon, où il contribue à l’homéostasie tissulaire et aux processus liés à la fonction barrière via des voies médiées par les RCPG telles que la signalisation AMPc/PKA et celle des GTPases Rho. GPR116 a été impliqué dans la régulation de l’équilibre du surfactant et de la fonction alvéolaire, et une expression altérée a été associée au remodelage inflammatoire et à des réponses fibrosantes dans les tissus respiratoires. Une dérégulation d’ADGRF5 a également été rapportée dans de multiples jeux de données transcriptomiques de cancers, ce qui étaye son utilisation dans des études portant sur les interactions tumeur–microenvironnement, la signalisation d’adhésion et la migration cellulaire.

GPR116 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADGRF5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR116 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADGRF5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADGRF5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR116. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADGRF5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR116 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR116 dans les cellules tumorales présentant une expression de ADGRF5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.