GMPPB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408461-ACT

GMPPB (GDP-Mannose-Pyrophosphorylase B) kodiert ein Enzym, das GDP-Mannose erzeugt – ein zentrales Donorsubstrat für Glykosylierungsreaktionen, die für korrektes Protein-Folding, den intrazellulären Transport (Trafficking) und Interaktionen mit der extrazellulären Matrix erforderlich sind. In menschlichen Zellen unterstützt GMPPB N‑gebundene Glykosylierung sowie O‑Mannosylierungswege, die insbesondere für die Glykosylierung von α‑Dystroglycan und anderen membranassoziierten Glykoproteinen wichtig sind. Eine Störung der Verfügbarkeit von GDP‑Mannose kann die ER‑Golgi‑Prozessierung verändern, die Zell‑Matrix‑Adhäsion beeinträchtigen und Signalnetzwerke stören, die von der Reifung von Glykoproteinen abhängen. Varianten, die die Funktion von GMPPB beeinflussen, sind mit neuromuskulären Phänotypen aus dem Dystroglykanopathie‑Spektrum assoziiert, wodurch dieses Gen für die Untersuchung glykosylierungsabhängiger Mechanismen in der Muskel- und Nervensystembiologie relevant ist.

GMPPB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GMPPB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GMPPB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GMPPB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GMPPB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GMPPB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GMPPB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GMPPB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GMPPB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GMPPB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.