Plasmide CRISPR d'Activation (h) Glutathione reductase: sc-417499-ACT

GSR code la glutathion réductase, une oxydoréductase flavoprotéique qui maintient l’homéostasie rédox cellulaire en régénérant le glutathion réduit (GSH) à partir du glutathion oxydé (GSSG) à l’aide du NADPH. Cette réaction est au cœur des défenses antioxydantes : elle favorise la détoxification des espèces réactives de l’oxygène et préserve l’équilibre rédox des thiols dans le cytosol et les mitochondries. En maintenant des voies dépendantes du GSH, telles que l’activité de la glutathion peroxydase et le métabolisme des xénobiotiques, GSR influence la fonction mitochondriale, le repliement des protéines et la protection contre les dommages oxydatifs. Un recyclage du glutathion dérégulé et un stress oxydatif accru sont associés à des mécanismes impliqués dans l’anémie, la neurodégénérescence, les dysfonctions métaboliques et la biologie des cancers, ce qui fait de GSR un nœud utile pour l’étude des phénotypes pilotés par le rédox.

Glutathione reductase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GSR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Glutathione reductase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GSR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GSR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Glutathione reductase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GSR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Glutathione reductase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Glutathione reductase dans les cellules tumorales présentant une expression de GSR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.