GLUD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402187-ACT

Das humane GLUD1-Gen kodiert die mitochondriale Glutamatdehydrogenase 1, ein NAD(P)+-abhängiges Enzym, das die reversible oxidative Desaminierung von Glutamat zu α-Ketoglutarat und Ammoniak katalysiert und so den Aminosäureabbau mit dem Citratzyklus (TCA-Zyklus) verknüpft. Durch die Regulation des Gleichgewichts zwischen Glutamatverwertung und anaplerotischem Flux beeinflusst GLUD1 die zelluläre Bioenergetik, die Redox-Homöostase und den Stickstoffstoffwechsel, mit nachgelagerten Effekten auf Neurotransmitter-Pools und die metabolische Kopplung. Die GLUD1-Aktivität ist mit Signalwegen verknüpft, die die Mitochondrienfunktion und die metabolische Signalübertragung steuern; eine veränderte Regulation wurde mit Erkrankungen in Verbindung gebracht, die den Aminosäureumsatz und eine neuroendokrine metabolische Dysregulation betreffen. Diese Eigenschaften machen GLUD1 zu einem relevanten Ziel für mechanistische Untersuchungen des mitochondrialen Stoffwechsels und glutamatabhängiger zellulärer Phänotypen.

GLUD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GLUD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GLUD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GLUD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GLUD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GLUD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GLUD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GLUD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GLUD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GLUD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.