GI24 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407831-ACT

VSIR kodiert den immunregulatorischen Rezeptor GI24 (auch bekannt als VISTA), ein Checkpoint-Molekül der B7-Familie, das überwiegend in hämatopoetischen und myeloiden Kompartimenten exprimiert wird und die T‑Zell-Aktivierung sowie die periphere Toleranz moduliert. GI24 ist an der Signalübertragung in der immunologischen Synapse und an suppressiven Signalwegen beteiligt, die die Zytokinproduktion, die Funktion antigenpräsentierender Zellen und das entzündliche „Grundniveau“ in Gewebemikroumgebungen prägen. Eine dysregulierte VSIR-Expression wurde sowohl mit veränderten Immunflucht-Phänotypen und Mustern der Immunzellinfiltration bei Krebs als auch mit aberranten Entzündungsreaktionen im Kontext autoimmuner und infektiöser Erkrankungen in Verbindung gebracht. Daher wird VSIR häufig in Signalwegen untersucht, die T‑Zell-Erschöpfung, myeloidvermittelte Immunsuppression und den Tumor‑Immun‑Crosstalk steuern.

GI24 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VSIR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GI24 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VSIR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VSIR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GI24-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VSIR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GI24-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GI24-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VSIR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.